Dinámica estructural inducida por la unión del ARN a la proteína de la nucleocápside del SARS-CoV-2

El síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), junto con todos los demás coronavirus, posee una nucleoproteína reguladora (N) que consiste en un complejo de nucleoproteína (RNP) rodeado por una envoltura lipídica.

estancia: Dinámica estructural de la proteína de la nucleocápside del SARS-CoV-2 inducida por la unión del ARN. Haber de imagen: Naeblys/Shutterstock.com

antecedentes

La proteína N es una de las cuatro proteínas estructurales de los coronavirus y es el componente principal de RNP. Además del empaquetamiento del genoma viral, la proteína N también se requiere para la replicación, transcripción, traducción y ensamblaje viral de RNP en partículas virales.

La proteína N consta de dos dominios estructurales y globulares que pueden unirse a moléculas de ADN y ARN (ARN) monocatenarias, que están representadas por los dominios N-terminal (NTD) y C-terminal (CTD). Además, la proteína N también consta de una extensa hendidura central de unión al ARN en forma de U para la unión y fusión de secuencias reguladoras de la transcripción (TRS).

El CTD ayuda a diluir la proteína y forma un surco positivo que puede reconocer la señal de empaquetamiento (PS), que conduce al ensamblaje de la RNP en partículas de virión. Además, las colas C flexibles también promueven la oligomerización.

El CTD y el NTD están conectados por un conector SR, que perturbó las regiones ricas en serina y arginina. Varios estudios han destacado que el conector SR se puede fosforilar, lo que reduce la afinidad de la proteína por el ARN y conduce a la separación en fase líquida de la proteína N con otras proteínas virales y ARN.

Estudios recientes han demostrado que la aparición de la cepa SARS-CoV-2 B.1.1.7 altamente transmisible está asociada con mutaciones del conector SR. Por lo tanto, es importante comprender la orientación de NTD y CTD, así como la contribución del conector SR y otras regiones desreguladas a la regulación general de la proteína N. Sin embargo, las estructuras tridimensionales (3D) del coronavirus de proteína N de longitud completa no están disponibles actualmente.

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Un nuevo estudio publicado en la revista PLOS de biología computacional Se utilizaron microscopía electrónica, análisis biofísico experimental, modelado molecular y simulaciones de dinámica molecular para predecir los modelos de estructura de la proteína N del SARS-CoV-2 de longitud completa tanto en presencia como en ausencia de ARN.

sobre estudiar

El presente estudio involucró el aislamiento del ARN del SARS-CoV-2, la transcripción inversa del ADN complementario (ADNc) y la clonación de la secuencia de la proteína N. La proteína N se expresó en bacteria coli Las células BL21 (DE3) se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y afinidad por metales.

La proteína N purificada se trató con RNasa A o la purificación se realizó en presencia de urea y una alta concentración de sal para producir proteína N sin contaminación de ADN.

A continuación, las muestras de proteínas se analizaron mediante dicroísmo circular FAR-UV, dispersión de luz dinámica, cromatografía de exclusión multiángulo (SEC-MALS), tinción e imagen negativas y procesamiento de imágenes. Se realizaron simulaciones de dinámica molecular de grano grueso (CG), seguidas de una comparación con datos biofísicos. Finalmente, se realizó un ajuste del modelo atómico en 3D, junto con simulaciones de la dinámica molecular de todos los átomos.

Resultados

La relación de absorbancia de 260/280 nm para la proteína N tratada con RNasa A disminuyó de 1,8 a 0,6, mientras que para la proteína N tratada con urea fue de 0,5. El perfil dicroico circular de la proteína tratada con urea y la proteína N tratada con RNasa A fue comparable.

Se detectaron varias partículas redondas con dimensiones inferiores a 5 milímetros (mm) en las imágenes de puntos negativos de las muestras tratadas con N urea. El análisis de estas partículas indicó que las distribuciones de la región de la proteína N tratada con urea encajan bien con las distribuciones de la región del dímero CTD y del monómero NTD. Esto indica que estas partículas corresponden a los dominios esféricos de NTD y CTD.

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Los resultados de la simulación CG no indican contactos NTD-CTD. Se observó una conformación altamente flexible de la proteína N de longitud completa en ausencia de ARN.

Además, se observaron innumerables partículas y agregados en muestras de proteína N que no se trataron con urea o RNasa A. Los agregados más grandes tenían entre 20 y 30 nanómetros (nm) de ancho, mientras que los agregados más pequeños tenían menos de 20 nm de ancho. Estas partículas tenían dimensiones dinámicas y, por lo tanto, se agruparon en siete clases.

También se observó que la proteína N sufre oligomerización y estrés en presencia de ARN, lo que se confirmó aún más mediante simulaciones de dinámica CG. El modelo totalmente atómico sugirió que los NTD están orientados uno al lado del otro frente a los dímeros de CTD y que todos los dominios ayudan a proteger el segmento de ARN. También se encontró que los residuos de arginina y lisina del conector SR interactúan con el ARN y los residuos de serina permanecen expuestos a los solventes.

Además, la reconstrucción del mapa de densidad 3D indicó cuatro esferoides conectados a través de los bordes en una configuración plana donde cada unidad esférica contiene un dímero N y la dimerización se induce a través de interacciones de van der Waals entre los residuos de la cola C-terminal.

Conclusiones

El estudio actual destaca la estructura y la dinámica de los oligómeros de alto orden de la proteína SARS-CoV-2 N. Esta información puede ayudar a proporcionar una mejor comprensión del papel multifuncional y versátil de esta proteína.

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